Western Blot檢測
作者：admin 發(fā)表時間：2015-04-13
服務(wù)價格 服務(wù)編號 價格 周期 CWS083 ￥1898/目的蛋白·膜 2周 服務(wù)內(nèi)容 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，摸索一抗稀釋度，選擇其中最佳的一個稀釋度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。 樣品要求 客戶需新鮮或正確保存的蛋白樣品，目的蛋白陽性表達(dá)樣品（有陽性表達(dá)的細(xì)胞或組織）， 檢測目的蛋白的一抗（或由康為世紀(jì)代購）。樣品要求為： ·裂解樣品總蛋白量>500ug/樣品。 ·細(xì)胞樣品總蛋白濃度＞1mg/ml?！ そM織樣品總蛋白濃度 10-15mg/ml。 終產(chǎn)品 ·曝光結(jié)果（膠片和掃描圖）； ·完整實(shí)驗(yàn)報告。 服務(wù)說明 ·建議提供目的蛋白陽性表達(dá)樣品（純蛋白或有陽性表達(dá)的細(xì)胞或組織）作為陽性對照?！ っ繌埬た蓹z測1-8個樣品?！ ひ豢剐柙谡_條件下保存，避免污染及反復(fù)凍融。 ·如需康為世紀(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，請另詢價。 ★Western blot操作流程介紹 1. 蛋白質(zhì)抽提 (1) 組織樣品，取適合量的新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品（非常重要），加1ml 含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑或其它蛋白提取試劑，勻漿后抽提總蛋白或核、膜蛋白?！ ?2) 細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1-1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑或其它蛋白提取試劑抽提總蛋白或核、膜蛋白?！ ?. 蛋白質(zhì)定量： BCA蛋白檢測試劑檢測蛋白的濃度。 3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE），用微量加樣槍準(zhǔn)確加樣到相應(yīng)的加樣孔中，安裝電泳分離蛋白?！ ?. 蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜上。按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4℃轉(zhuǎn)移過夜。 5. 膜的封閉和抗體孵育 (1) 膜在5%BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非物異結(jié)合?！ ?2) 封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育膜1.5h,抗體抗原結(jié)合?！ ?3) 加入HRP標(biāo)記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量 標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時，加入HRP標(biāo)記的GAPDH/b-actin抗體可以同時檢測 GAPDH/b-actin含量。 6. 結(jié)果檢測：化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X光膠片曝光顯影。
